Полимеразната верижна реакция (Polymerase Chain Reaction, PCR) е експериментален метод от молекулярната биология и молекулната диагностика. Реакцията е открита от Кари Мулис (виж www.karymullis.com). Тя се състои от няколко стъпки, след които броят на началните ДНК молекули е увеличен. Това е необходимо, когато няма на разположение достатъчно ДНК за експерименти и анализ.

Този метод определя самата ДНК или РНК и позволява да се осъществи директно откриване например на инфекциозен агент или на генетична мутация. С негова помощ една молекула ДНК може да се открие в присъствие на милиони други молекули ДНК, все едно да се търси игла в купа сено.

Методите на ДНК диагностиката са незаменими в пренаталната диагностика на наследствените заболявания, като миодистрофията на Дюшен и Бекер, муковисцидозата, фенилкетонурията, хемофилията, атаксията на Фридрейх и спиналните амиотрофии, установяване на пола на детето. Пренаталната диагностика проведена в първото тримесечие на бременността позволява да се предотврати раждането на дете с тежки наследствени патологии, а в случая на недостатъчност на 21-хидроксилазата да се проведе и дородово лечение. В имунологията може да се установи какви гени контролират синтеза на едни или други съединения и медиатори на имунния отговор, да се провежда типиране на тъкани.

Методът се състои в ин витро ензимно намножаване (амплификация) на избрани нуклеотидни последователности, ограничени от известни секвенции.

Във всяка амплификационна реакция участват:

• ДНК — матрица за осъществявания процес, получена след топлинна денатурация на специфична ДНК.
• Taq-полимераза — осъществява процеса на копиране на желаната ДНК последователност. За първи път е изолирана от микроорганизма Termophylus aquaticus. Ензимът Taq-полимераза е термостабилен и запазва своята активност от 45 до 60 минути при 94°С — т.е. през целия амплификационен процес. Оптималната температура за синтез с Taq-полимеразата е 72°С.
• Праймери (зародиши) — представляват къси синтетични олигонуклеотиди (14—40 нуклеотида), комплементарни на ограничаващите намножаваната последователност участъци. От тях започва синтеза на ДНК при всеки нов цикъл на PCR-реакцията. Оптималната концентрация на праймерите в амплификационната реакция е 0,1 — 1,0 μМ. Праймерите се подбират за консервативни участъци от ДНК молекулата на инфекциозния агент, които са малко подложени на генетични изменения.
• Дезоксирибонуклеотидтрифосфати — дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ — Служат като субстрат за изграждане на новосинтезиращата се верига, като се включват избирателно на принципа на комплементарност. Задължително условие е четирите типа дНТФ да присъстват в еквимоларни количества в реакционната смес, защото количеството в повече на някой от тях може да доведе до неправилно сдвояване на нуклеотидите при провеждане на реакцията. Оптималната концентрация е 20 до 200 μМ за всеки нуклеотид.
• Реакционен буфер — осигурява подходящото pH=8,3 — 9,0 на средата и необходимите йони за работа на ензима. Включва в състава си 10-50 mM Tris-HCl с рН=8,3-9,0 ; до 50mM KCl и 0,5-5,0 mM MgCl₂. Освен това, може да съдържа и желатин, говежди серумен албумин (BSA), нейонни детергенти (като DMSO — диметил сулфооксид) и други. Компонентите на буфера могат да варират качествено и количествено, в зависимост от изискванията на конкретната Taq-полимераза.

ЕТАПИ:

Полимеразната верижна реакция започва с първоначална продължителна денатурация, която цели разделяне на двойната верига на ДНК. Амплифицирането на желания участък се осъществява при условия на многократно повтаряне на серия от цикли с определена температура, всеки от които включва следните три стъпки:

1. Термична денатурация (denaturation)

   При 90 до 97°С се осигурява пълно разделяне на двойноверижната ДНК до едноверижни матрици за амплификация;

2. Хибридизация (annealing)

   Осъществява се между праймерите и комплементарните им участъци от матричната едноверижна ДНК. Температурата на това взаимодействие е строго специфична и се изчислява в зависимост от базовия състав и дължината на използваните праймерни секвенции. Емпирично тя може да бъде изчислена по следната формула:

   tC_annealing = (A+T)x2+(G+C)x4-5C

3. Синтез (extension)

   Синтезиране на нова, комплементарна на матричната ДНК-верига е в посока 5→3. Температурата на този етап се определя от особеностите на използвания ензим и осигурява най-високата активност на ДНК-полимеразата. Обикновено температурата е около 72°С.

• Крайна фаза

Обикновено след последният цикъл температурата се задържа на 72°C от 5 до 15 мин. Това се прави с цел завършване на частично елонгираните продукти. След PCR епруветките се съхраняват при -20°С.

Характеристики на PCR - анализа : висока чувствителност, като има разлика между  аналитична и диагностична активност.

Аналитична чувствителност е това минимално количество от копия на ДНК или РНК в един милилитър от разтвора образец, което може да бъде определено с дадената тест система.

Диагностична чувствителност - оценява се в проценти и определя количеството пациенти  с даденото заболяване, даващи наистина положителни резултати при използване на конкретния набор.

Чувствителността се определя като съчетание на три фактора: ефективност при определянето на ДНК причинителя, чувствителността въобще на PCR и чувсвителността на избрания за индикация метод.

Друго предимство е диагностичната специфичност на PCR тест-системите, която се определя от процента на здравите хора, които наистина имат отрицателни резултати от анализа, тя също е много висока. За PCR-наборите тя се оценява на 99-100%. Възможностите заложени в PCR-анализа, позволяват да се достигне ненадмината диагностична специфичност, което се доказва от отсъствието на кръстосани реакции със сходни  микроорганизми или други агенти.  

Специфичност на диагностикума - това е способността да се улавят определени причинители на инфекции на фона на всякакви други микроорганизми, вируси и клетки на организма хазяин. От тази гледна точка възможностите на PCR са уникални.

Диагностическата чувствителност и специфичност на PCR са съпоставими, а често и превъзхождат наречените “златен стандарт” за диагностика на инфекциозни заболявания културални методи. Изследвания във водещи световни лаборатории са доказали, че подредством PCR се откриват с 10% повече положителни проби например за Хламидия Трахоматис, отколкото чрез културални или други методи. Като се вземе под внимание и продължинелността на култивирането /от няколко дни и седмици до месеци/, то преимуществото на PCR метода стават несъмнени. Получаването на резултатите от PCR става за един работен ден. Проведена е клаксация по чувствителност в световен мащаб на различни методи за диагностика:

• експресни тестове - 40 - 60 %

• ELISA-50 - 70 %

• пряка имунофлуоресценция - 55 - 75 %

• културални изследвания - 60 - 80 %

• PCR - 90 - 100 %

Като се сумират преимуществата на метода в диагностиката на инфекциозните заболявания може да се каже:

• позволява да се откриват патогенните за човека бактерии и вируси в тези случаи , когато това по друг начин не е възможно;   

• за диагностика може да се използва само един набор от прибори и реактиви , които незначително се различават един от друг , което е обусловено от химическото сходство на нуклеиновите киселини;

• отпада необходимостта от специфични хранителни среди , клетъчни култури;

• възможно е поставянето на диагнозата при серонегативни пациенти в най-ранни стадии от развитие на инфекциозния процес;

• лесно се определят причинители за които не са разработени или са много трудни за изпълнение методите на култивиране;

• методът позволява да се постави диагноза в течение на работния ден;

• има висока чувствителност и специфичност - до 1 - 5 причинителя в проба;

• анализът се извършва в минимално количество проба;

• възможна е едновременната диагностика на няколко микроорганизма в една проба.

Чрез PCR може да се изследват различни биологични образци: цитонамазки, кръвни проби, серум, левкоцити, урина, сълзи, ликвор, лаваж, мляко. Например за диагностика на  полово предаваните заболявания /хламидия трахоматис, микоплазма, уреаплазма и др./ като правило се прави цитонамазка от епителни клетки от цервикален канал или уретра, може да се използва слюнка, урина.

Бази данни

Nucleotide sequence data bank:

The European Nucleotide Archive (ENA)
Europe's primary comprehensive nucleotide sequence data resource
DDBJ
DNA Data Bank of Japan the sole nucleotide sequence data bank
GenBank^® is the NIH genetic sequence database
The National Center for Biotechnology Information

The Sequence Read Archive Documentation
The Sequence Read Archive (SRA) stores raw sequencing data from the "next" generation of sequencing platforms

Допълнителна информация:

"The Nobel Prize in Chemistry 1993". Nobelprize.org. 3 Aug 2011 http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/
 

Константин Докторов                                                                                                             03.07.2011

I начало I за реклама I условия за ползване I контакти I

Copyright ©  2009 Chem-bg.com <The Life Science Portal>. Всички права запазени!